细胞培养入门课 | 第二讲：hPSC的鉴定
上一期hPSC细胞培养入门课中的同学在STEMCELL技术助手的帮助下已经成功建立起了iPSC细胞系。这次，他在hPSC的鉴定上出现了一些疑问，就让我们一起来看看这些问题该如何解决吧！
问题1：什么情况下需要对hPSC进行质量鉴定？
答：我们建议在以下几种情况下都需要及时对hPSC进行鉴定：
1、体细胞重编程为iPSC后：由于早期的iPS细胞尚未完全重新编程或稳定（例如表观遗传学变化、DNA 损伤等），它们可能暂时无法有效地进行分化，因此可能需要进一步培养传代，建议培养到第15代后，再进行质量鉴定，来确认您重编程的细胞是否已经具有iPSC的特征与分化潜能。
2、hPSC长期在体外维持培养：在hPSC长期在体外传代后，部分细胞可能出现染色体和遗传变异，而异常的hPSC亚群可能会出现生长优势，从而影响整个细胞系，因此我们推荐在连续维持培养每十代左右就及时对细胞系进行鉴定。
3、hPSC形态、增殖、分化能力等出现异常时：hPSC在体外生长时是有分化倾向的，能够分化成三个胚层的是hPSC具有多能性的表现。在细胞培养中，只要能够在传代时将分化区域去除，有限的自发分化比例（5 - 10%）不成问题。但当出现过多的分化区域无法通过传代去除，集落中的细胞形态变得不再均一，或增殖速度出现明显变化时，可能是hPSC出现问题的信号。
4、hPSC基因编辑前后：选用分化比例低、核型变异率低、具有多能性的hPSC细胞系是进行基因编辑的基础，由于被基因编辑的hPSC需要经过克隆挑选的步骤，高质量的hPSC可以规避检验大量不符合要求的克隆，保证了后续实验的高效性、一致性、可靠性和可重复性。当然，基因编辑后挑选出的克隆依然需要进行鉴定。很多hPSC研究实验室会用不同的检测方法来保证hPSC细胞维持在正常未分化的状态，例如：集落形态鉴定，表面与胞内标记物表达，染色体核型分析以及三胚层分化等等。
问题2：hPSC克隆的正常形态是什么样的？如何区分分化与未分化区域？
答：正常hPSC的集落形态通常为扁平致密的圆形，具有清晰平滑的边缘。而集落内部的干细胞小而圆，形态均一，具有明显的细胞核和较少的细胞质，核质比较大。在培养过程中集落边缘可能会出现自发分化，使边界变得不规则，少量的自发分化是hPSC多能性的体现（图1）。mTeSR™培养基（#85850；#100-0276）中的多能干因子可以避免细胞分化，然而培养中低比例（小于10%）的自发分化是正常且健康的。但当hPSC集落中心过于紧密，也可能出现分化，它们的形态会与周围正常的hPSC细胞表现出明显的差异，因此当观察到集落中心细胞接触非常紧密，出现多层细胞时应及时进行传代。
图1：培养在Corning® Matrigel® mTeSR™1上的人iPS细胞的形态
(A) 未分化的人iPS细胞 (WLS-4D1和WLS-1C)。(B) 分化区域 (橙色圆圈) 位于未分化的WLS-1C集落边缘。放大倍数：20倍、40倍和400倍。
问题3：hPSC的未分化标志物有哪些？而分化后的细胞又会有哪些标志物表达？
答：为了维持细胞的干性，hPSC需要表达一些关键转录因子，如OCT4(#60093)，SOX2和Nanog等，它们会参与调节与细胞分裂、分化和发育有关的基因的表达。此外，通常hPSC还会表达一组特定的细胞表面蛋白，如SSEA-3(#60061), SSEA-4(#60062), TRA-1-60(#60064), TRA-1-81(#60065), TRA-2-49, TRA-2-54等。对这些标志物的检测是鉴定hPSC干性的重要步骤。
另外，是否能分化为外胚层、中胚层和内胚层也是检验hPSC细胞多能性的关键标准，因此对分化标志物的检验也具有非常重要的意义。当分化至外胚层时，PAX3、Nestin、OTX2等基因表达量会明显升高，而中胚层中Brachyury、N-cadherin等表达升高，内胚层则是SOX17、CXCR4、FOXA2等。值得注意的是，当hPSC分化为目标细胞类型后，还应该检查细胞是否不再表达上述未分化的细胞标志物。
问题4：hPSC的标志物检验方法有哪些？
答：主要检测方法包括用特异性抗体标记细胞，然后通过western blotting (WB)，免疫细胞化学（ICC），流式分析（FACS）等方式鉴定标志物的表达。同时，qPCR也可以用于检测这些标志物在mRNA层面的表达，STEMCELL的Human Pluripotent Stem Cell Trilineage Differentiation qPCR Array（#07515）包含了90个验证过的未分化、外胚层、中胚层、内胚层标志基因和用于对照的管家基因，可用于检测未分化hPSC和不同分化阶段的细胞的基因表达水平。
(A) 胞内标志物OCT4 。(B) 表面标志物SSEA-3。
问题5：什么情况需要进行hPSC核型鉴定？核型鉴定方法又有哪些呢？
答: 长期的体外培养会导致细胞倍增时间变短，传代时更多细胞贴壁，这个现象通常与核型改变有关，因为核型异常的细胞通常具有生长优势。不同的传代解离方式、细胞种植密度等因素都有可能导致体外培养的hPSC核型的不稳定，因此定期检查hPSC培养物以排除核型变异至关重要。目前，主要有以下几种鉴定方法：
1、G显带核型分析是最传统核型检测方法，通常选择在增殖旺盛期对细胞进行秋水仙素处理，使它们停止在分裂中期，而后用Giemsa染色，染色体上会出现宽窄和亮度不同的条带，可用于分辨染色的结构、数目异常。但是由于该方法分辨率低（5M-10Mb），耗时长（1-2周），实验复杂，通常需要在专业机构、医院或公司进行检验分析。
2、荧光杂交（FISH）是另一种判断核型的方法，它利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内目标DNA分子杂交，通过在荧光显微镜下观察，来确定杂交位点的数量与分布位置，该方法虽然分辨率高（100-200Kb），却只能观察特定的序列，无法检测选定的区域外的异常。
3、微阵列（CGH array/SNP array）和全基因组测序（WGS）则是更为先进的基因检测方法，能够全面覆盖所有染色体，可以较为精确地检出不平衡易位、倒位、缺失、重复和非整倍体，但是无法检测平衡易位和特定位置染色体的重复，而且价格昂贵，耗时很长（2-3周）。
4、hPSC基因检测试剂盒（#07550），利用了qPCR技术检测拷贝数变异（CNV）的原理，虽然同样无法检出平衡易位，但该试剂盒可以快速高效地针对多种人ESC和iPSC细胞系进行筛查，一个试剂盒可供20个样本进行三重复实验，性价比高。该试剂盒的检测范围包括75%文献报道过的hPSC高频突变位点，能够检出30%以上的嵌合，最重要的是，当天即可获得结果，搭配在线的hPSC基因检测工具可方便地实现qPCR数据分析和解读。
问题6：如何鉴定hPSC分化能力，确保hPSC具有多能性？
答: hPSC的分化能力鉴定主要有以下三种途径：
1、畸胎瘤检验，通过将一定数量的hPSC注射入免疫缺损的小鼠体内，并在4 - 12周后形成畸胎瘤。畸胎瘤包含代表内、中、外三胚层结构的组织，并且可通过组织学检验分析，确认来自于各细胞谱系细胞的存在。但是畸胎瘤检测费时费力，若检测数量多则需要消耗大量的实验动物，费用巨大。
2、拟胚体（Embryoid bodies，EBs）形成实验，通过将hPSC在体外进行3D成球培养并分化，形成具三胚层、形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段有着很高相似度的拟胚体。由于EB球的大小会直接影响它的分化轨迹，而传统刮擦的方法形成的EB球由于大小并不均一，因此容易导致不充分的或不受控的分化。AggreWell™培养板（#34411，#34811）可以为EB球形成提供一个标准化的方法，能够形成大小一致的的EB球。
图3：不同方式形成的EB球形态
(A) 传统刮擦的方法形成的EB球。(B) AggreWell™培养板形成的EB球。
3、体外三谱系分化试剂盒（#05230），该试剂盒提供了一种简单、具有重复性的方法检验hPSC向三胚层分化的能力。它的成分确定， 可以同时分化三种谱系，一周内即可完成实验流程。由于该系统中向不同胚层的分化是在不同的培养孔中独立进行的，比如，再检验定型内胚层分化的培养孔中，细胞表达定型内胚层标志物，而非外胚层或中胚层标志物，因此与体外自发分化的实验相比其结果更为清晰。而且体外三谱系分化后，可以进行各种下游鉴定实验得到清楚、定量的检测结果，如 ICC, FACS或转录组分析等，亦可搭配STEMdiff™ hPSC三谱系分化qPCR阵列（#07515）使用。经验证，不同的hPSC细胞系均可重复生成三胚层，一个试剂盒足够用来做24个细胞系。想深入了解分化能力鉴定的实验步骤可咨询官方技术支持（info.cn@stemcell.com）。
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