第一讲：hPSC的获取与培养 >

第二讲：hPSC的鉴定 >

问题1：hPSC冻存有哪些冻存配方？

答：hPSC冻存配方通常有两种，一种是含血清的传统冻存配方，通常含有10%DMSO和50 - 90% FBS，但血清成分不确定，且存在批次间差异较大的问题。另一种是不含血清的冻存配方（含DMSO），如mFreSR™ （#05855）, FreSR™-S（#05859）和cGMP级别的CryoStor® CS10（#07930），它们的成分确定，适合与成分确定的培养基配合使用，比如mTeSR™系列培养基（#85850；#100-0276）。

STEMCELL不仅提供hPSC专用的冻存液，更有适用于其他细胞的冻存配方供您参考 >

问题2：hPSC的单细胞冻存与团块冻存有什么区别?

答：单细胞传代的优点在于更容易进行计数，能够更好地预估解冻后复苏所需时间，而且理论上说单细胞冻存能够让细胞更均匀、完全地接触冻存液，因此可能有更高的存活率。但是我们通常不推荐连续使用单细胞方法进行冻存，因为单细胞冻存后需要加入Y-27632（#72302）来防止细胞凋亡，但这容易增加细胞核型异常的风险。

因此我们推荐使用标准的方法进行团块冻存。在冻存前，使用团块传代解离试剂，如ReLeSR™（#05872），Gentle Cell Dissociation Reagent（#100-0485），EDTA和Dispase（#07923）等解离细胞。要尽量保证细胞团块较大、较完整，因为在解冻后洗去DMSO时，较小的团块会容易散落成单细胞，不利于hPSC复苏。

问题3：hPSC的推荐冻存密度是多少呢？

答：若使用团块冻存，一个2mL冻存管可以冻存6 孔板的1个孔（约为每孔2.5-3x106 个细胞），这些细胞可以复苏至6孔板的一个孔中。若使用单细胞冻存，则推荐冻存密度为1x106 细胞/管，同样可复苏至6孔板的一个孔中。

正常的hPSC解冻复苏率计算公式为：

复苏率 = 解冻后贴壁细胞数(团块数)/冻存前细胞数（团块数） x 100%

传统冻存液复苏率在0.1 – 1%；而mFreSR （#05855）在3-12%。

问题4：冻存hPSC时降温方法有哪些？

答：1、缓速降温法：细胞加入冻存液后，立即将冻存管置于室温的异丙醇冻存盒内，并快速放入-80°C冰箱，温度将以每分钟1度的速率降低，达到-80°C后可以在-135°C液氮或更低的温度长期保存。我们不推荐将hPSC放在-80°C长期保存。
2、逐步降温法：则是将冻存管在-20°C保存2个小时，然后在-80°C中保存2个小时，随后可以在-135°C液氮中或更低的温度长期保存。

问题5：解冻hPSC时有什么技巧吗？

答：hPSC需在37°C恒温水浴中快速解冻，持续温和地在水中晃动冻存管，直到剩余少量细胞还处于冻存结晶状态，立即取出。用1 mL的移液器枪头将冻存管中的细胞悬液缓慢地转移到含有5 - 7 mL的DMEM/F-12的15 mL的离心管中。再在室温（15 - 25°C）下以300 x g离心5分钟。随后用吸管小心的去除上清液，留下少量培养基确保细胞团未被扰动。将细胞轻轻重悬于1mL培养基中，并转移至被基质包被好，且含有2mL培养基的孔板中，上下左右轻轻摇晃孔板以保证细胞均匀分布、沉降。

问题6：什么情况下需要在解冻时加入Y-27632?

答：1、单细胞冻存的hPSC解冻时需要加入10 μM的Y-27632（#72302），CloneR™（#05888）或CloneR™ 2（#100-0691），以保证hPSC单细胞的存活。

2、当样本低温保存年限过长时，解冻也可以加入10 μM的Y-27632（#72302），CloneR™（#05888）或CloneR™ 2（#100-0691）提高hPSC的复苏率。

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问题7：hPSC复苏多久之后可以进行扩增？

答：在扩增hPSC细胞系前需保证细胞已经达到合适的密度。以6孔板为例，若解冻后贴壁的细胞colony过少，当colony形态达到传代要求时尚不足以传至两个孔 (350个细胞团块/孔，共700个团块)，则需要先进行1：1传代，直至团块数量能够满足要求。