你问我答 | 如何高效分选免疫细胞

常见问题

1. ILC2分选有什么好方法啊？

ILC2分选有人和小鼠物种区别，如果使用物种来源是鼠，STEMCELL有对应的EasySep™ Mouse ILC2 Enrichment Kit可以特定富集小鼠的ILC2，富集后纯度可以达到CD45+population的20%以上，另外对于ILC有全ILC富集盒EasySep™ Mouse Pan-ILC Enrichment Kit，纯度不是特别高，可以先富集，富集之后再进行后续培养或进一步流式分选，可以把流式分选时间减到十分钟左右，富集之后纯度可以达到50%。如果使用物种来源是人，ILC2有分选试剂盒 EasySep™ Human ILC2 Isolation Kit，但是ILC2细胞本身在人血中的滴度比较低，一般不超过1%，所以如果要是从人血中分选ILC2的话，建议前期准备较多一点的血量，STEMCELL对于人的ICL2分选试剂盒效果非常不错，纯度大于90%，推荐大家使用。

2. 想请教一下单核细胞分选?

针对单核细胞分选，有两个负选盒子，EasySep™ Human Monocyte Enrichment Kit（产品号#19059）和EasySep™ Human Monocyte Isolation Kit（产品号#19359），19359是19059的一个更新版，它可以在样本PBMCs中有较多血小板时更干净地去除血小板，但是对于血小板含量较低的样本，用普通的单核细胞分选试剂盒19059即可。STEMCELL针对单核细胞也有正选试剂盒，正选以CD14为marker，分选出来CD14阳性单核细胞，CD14+被普遍认为是人单核细胞的marker。分选手段的选择也取决于具体是做分化还是其他下游实验，如果想做单核细胞向巨噬/树突细胞的分化，负选试剂盒即19059/19359比较推荐，因为分选后得到的细胞是CD14+CD16-单阳性的经典单核细胞，因为CD14+CD16+双阳目前被普遍认为是非经典单核细胞，它其实是不具备分化潜能的，所以如果用全部的CD14+单核细胞进行分化实验，还包括了单核细胞里面20%左右的双阳细胞，可能导致分化后的流式染色图不会很理想。所以一般推荐正常样本用负选去选单核，只保留CD14+CD16-的细胞，继续进行树突或巨噬分化。但是对于无分化实验需求的单核细胞分选客户，负选试剂盒也有EasySep™ Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion，即不去除CD14+CD16+单核细胞。

3. 组织定植的免疫细胞（比如肺泡巨噬）有什么好的分选方法吗？

组织定植的免疫细胞，例如肺泡巨噬细胞等，如果有特定marker，比如说小鼠的肺、肝脏、腹水巨噬细胞的分选是以F4/80为marker，如果巨噬细胞本身是一个必须多marker定义的亚群,不是一个单个marker可以特异性分选出的比较成熟的巨噬细胞，首要推荐流式分选，但是对于已经有公认marker的，比如说小鼠的F4/80或人的CD11b，是可以采用免疫磁珠分选方案的。

4. 有没有分选后T细胞的冻存方案？

分选后T细胞的冻存我们有GMP级别的原代免疫细胞冻存液，CryoStor® CS10冻存液，是STEMCELL的王牌产品，很多客户在用这个，用它冻存T细胞之后复苏的活性可以达到90%。

5. 有没有成纤维细胞的分选?

成纤维需要客户自己选择一个marker，即自己平时做流式定义成纤维细胞的marker，STEMCELL提供间接选择试剂盒，可以有4种不同的方案，分别是EasySep™ Human PE Positive Selection Kit II、EasySep™ Human FITC Positive Selection Kit II、EasySep™ Human APC Positive Selection Kit II、EasySep™ Human Biotin Positive Selection Kit II，即可以用这四种之一交联的抗体与细胞结合，按照我们的分选流程分选出被标记的目的细胞，达到分选的效果。

6. T细胞扩增用的CD3CD28 是不是扩增后期可以减少用量？

如果采用的是STEMCELL的ImmunoCult™ Human CD3/CD28 T Cell Activator，只需要加两次，第一次是在开始种板的时候（Day0），第二次是在第11天重新种板的时候(Day11)。中间是不需重新加的，因为反复加入Activitor首先是浪费，再者容易引起细胞经历反复刺激带来的耗竭，所以建议按照Activator的说明书进行扩增。

7. 有分离大鼠Treg的试剂盒吗？

大鼠Treg，STEMCELL暂时没有成品试剂盒，但是可以使用自己的抗体配合上边第五个问题所提到的间接分选方案进行Treg分离。

8. 想看动物造模后Treg细胞分泌细胞因子的情况，把Treg细胞分离出来，会在培养条件分泌细胞因子吗？

会，正确添加刺激会分泌细胞因子，Treg自己也会分泌抑制性细胞因子。细胞分选后在体外刺激，刺激同同时加入golgi blocker可以进行流式检测，或者取培养上清做ELISA检测。如果在体内造模，分选后看 Treg活化的情况，如果此模型的Treg活化程度较高，可以尝试只加golgi blocker，试一下流式可否检测到分泌。这个和分选无关，STEMCELL的人/鼠试剂盒都可以分选出高纯度（不低于90%）的Treg，但是后期的细胞因子检测结果还要看活化程度和分泌量。

9. Treg在体外维持和扩增的方案有什么差别吗？

不扩增只是体外在培养基中放置几天,可以只加IL2，以适合的密度培养在培养基中，用1640+FBS或T细胞培养基都可以，Treg由于本身的特性，细胞凋亡比较慢。扩增需要加ImmunoCult™ Human CD3/CD28 T Cell Activator，可以选择性的加一些体外补充的TGFb还有retinoic acid，促进Treg扩增，即补充一些对Treg有益和需要的细胞因子，以及Treg扩增必备的IL2。IL2浓度比起培养总T细胞要稍高，50-100U/ml都可以。