技术方案 | 使用HepatiCult™类器官生长培养基复苏和扩增人肝脏类器官

正确复苏冷冻保存的类器官可以极大地增加类器官的复苏活率。以下是使用HepatiCult™生长培养基 (人)复苏和扩增培养冻存的肝脏类器官的方案。

所需耗材及试剂

准备工作

1. 在2-8°C下过夜解冻HepatiCult™类器官生长添加物，制备完整的Hepaticult™类器官生长培养基 (OGM):

注意：HepatiCult™类器官生长添加物解冻后请立即使用或者分装后存储在-20°C。分装管一旦解冻，请立即使用，不要反复冻融。配制完全的HepatiCult™ OGM可在2 - 8°C下保存长达2周。使用前将完全培养基预热至室温 (15 - 25°C)。

2. 制备15 mL DMEM+BSA Solution（以下体积可用于复苏三个冻存管的人肝类器官）:

注意：如果不立即使用，配制完整的DMEM+BSA Solution可在2 - 8°C下储存长达4周。使用前将试剂预热至室温。

3. 将24孔板（Tissue culture-treated）置于37°C培养箱中预热至少1小时。

4. 将Matrigel® 放置于冰上溶解(每个Dome约使用40 µL Matrigel)。移动Matrigel®时需要将其保持置于冰上的状态，以防止凝固。

注意：如果有需要，类器官也可以使用Dilute Matrigel® suspension的方法进行培养。可参考文章末尾链接方案。

5. 向15 mL锥形管中加入2 mL DMEM+BSA Solution（每次复苏一个冻存管）。

6. 从液氮中取出冻存管，放在干冰上，直到准备复苏。

操作步骤

1. 一次复苏一个冻存管的肝类器官，将冻存管置于37°C水浴解冻2-2.5分钟。当冷冻介质完全融化为液体时，解冻完成。立即进入下一步，类器官复苏。

2. 用70%异丙醇擦拭冻存管的外部，然后转移到无菌操作台中。

3. 小心地打开冻存管的盖子，并向冻存管中加入1 mL DMEM+BSA Solution，上下吹打4次混合均匀，立即将类器官悬液转移到新的含有2mL DMEM+BSA Solution 的15 mL离心管中。

4. 用1 mL DMEM+BSA Solution洗涤冻存管内残留的细胞并将洗涤液转移到15 mL的离心管中。重复该操作。

注意：含有解冻细胞碎片的15 mL离心管可以先放置在冰上保存，此时开始解冻额外的冻存管。

5. 全部解冻完成后，290×g，离心五分钟。尽可能多地去除上清液，将离心管放在冰上。

6. 将预热好的24孔板（Tissue culture-treated）从培养箱中取出，放置在无菌操作台中。

7. 接下来按照以下说明一次操作一个离心管内的细胞沉淀。务必动作快速以确保 Matrigel®不会凝固。吸取Matrigel®时使用预冷过的移液器枪头，以帮助减少Matrigel®的过早凝固。

注意：24孔板中间的8个孔是最适合接种Dome的，因为它们的表面最平整均匀。培养板边缘的孔通常略微倾斜，这导致Dome和孔壁接触可能会变平坍塌。

使用预冷过的200 µL枪头吸取 60 µL 解冻的 Matrigel®加入到肝类器官碎片内。上下吹打5-8次，轻轻混合Fragment-Matrigel®悬浮液，避免产生气泡。
向24孔板的中间8个孔，中心位置加入 35 µL Fragment-Matrigel®悬浮液以形成Dome。在缓慢加入Matrigel®悬浮液时，逐渐向上移动枪头，使肝类器官碎片均匀分布在整个Dome中。移液枪只打到第一档就停止，以避免在Dome顶部产生气泡。

8. 对剩余的类器官碎片重复步骤7。

9. 盖培养板盖子，小心地将24孔板置于37°C，5% CO2的培养箱中，放置10分钟，使Dome凝固。

10. 将培养板从培养箱中取出，放入无菌操作台中。

11. 在不碰到Dome的情况下，小心地沿着孔壁侧面加入750 µL室温的完全HepatiCult™ OGM培养基。不要将培养基直接加到Dome上。

12. 在剩下的孔中加入无菌的PBS，盖培养板盖子。

13. 在37°C，5% CO2下孵育培养板，直至传代（最长一周）。

注意：每天观察肝类器官的生长形态变化。在管腔变暗和Dome塌陷之前要及时的传代。肝类器官大概需要每7-10天传代一次。

14. 每2-3天进行一次全换液，在室温(15 - 25°C)下，小心吸走培养基并加入750 µL新鲜的完全培养基Hepaticult™ OGM。

注意：如果 Matrigel® Dome松散，请从孔中吸出500 µL培养基，然后加入500 µL新鲜培养基。为避免周末更换培养基，请在周一、周三和周五进行换液。